蚌埠医学院学报

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基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

曹玉洁, 张玲红, 苗昱辰, 卢里, 李春草, 张璐, 胡瑞, 李江艳, 夏惠, 陶志勇, 方强

2023, 48(1): 60-65. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2023.01.012

关键词: 约氏疟原虫, PALM基因, 基因敲除, CRISPR/Cas9

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目的基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息, 设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂, 将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接, 构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体, 尾静脉注射感染小鼠, 24 h后采血查获疟原虫后, 给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫, 喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定, 最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠, 8 d后采血镜检疟原虫, PCR鉴定, 筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内, 每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)。对感染后的小鼠每2天鼠尾取血制作血涂片, 经吉姆萨染色后镜检计算原虫率, 记录数据进行统计学分析。结果PCR扩增出的PALM左右同源臂各600 bp以及sgRNA序列, 与载体pYCm-golden-blue连接后成功获得用于电转染的PALM基因敲除的CRISPR质粒。该质粒电转染的疟原虫在小鼠体内经药物压力筛选8 d, 用PALM基因内部引物经PCR检测显示PALM基因缺失, 用基因组特异性引物经PCR检测出现阳性重组条带, 片段长度1 246 bp。随后将阳性重组条带切胶测序, 测序结果进一步证实PALM基因敲除成功。在获得约氏疟原虫PALM基因敲除株的基础上, 通过有限稀释感染12只小鼠, 经PCR自2只小鼠血液中扩增出单一PALM基因敲除条带, 检测不到野生型疟原虫的残留, 获得了2个100%PALM基因敲除的单克隆虫株。PALM基因敲除单克隆株与P.yoelii 17XNL感染小鼠后均出现原虫血症, 且2组小鼠原虫率逐日升高。感染后第10天, 2组小鼠原虫血症水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建并单克隆化PALM基因敲除的P.yoelii 17XNL虫株, 为疟疾遗传减毒红前期活疫苗研发提供准备。

猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建

方强, 孙新, 夏惠, 徐胜贵, 胡守锋, 杨小迪, 陈兴智, 王雪梅

2006, 31(4): 334-335.

关键词: 带绦虫, 六钩蚴, TSO45-4B, 重组质粒

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猪带绦虫六钩蚴TSO45-4B抗原FnⅢ结构域相应的线性B细胞表位肽免疫原性研究

王媛媛, 陶志勇, 杨小迪, 王小莉, 常雪莲, 陈勇, 孙新, 夏惠, 方强

2013, 37(5): 513-515.

关键词: 猪带绦虫, 六钩蚴, TSO45-4B, FnⅢ结构域, B细胞表位, 免疫反应

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结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

薛玉芹, 王英, 陈勇, 李江艳, 李倩, 唐洁, 夏惠, 王雪梅, 方强

2013, 37(11): 1385-1388.

关键词: 结核分枝杆菌, H37Ra株, 培养滤液蛋白10基因, 克隆, 序列分析

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间日疟现症患者外周血树突状细胞亚群的变化

买月琴, 陶志勇, 刘丹, 陈勇, 方强, 李柏青, 夏惠

2012, 36(10): 1144-1146.

关键词: 间日疟, 树突状细胞, 流式细胞术, 免疫应答

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2006～2010年安徽省疟疾流行时空分布特征

焦玉萌, 方强, 谢旻, 陶志勇, 王雪梅, 夏惠, 孙新

2013, 37(7): 876-878,883.

关键词: 疟疾, 发病率, 流行特征

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次氯酸钠法孵化猪带绦虫卵的观察

方强, 孙新, 夏惠, 胡守锋

2004, 29(2): 97-98.

关键词: 猪带绦虫, 虫卵, 次氯酸钠, 孵化

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间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达与初步鉴定

高迎, 陶志勇, 夏惠, 陈勇, 王雪梅, 方强

2013, 37(7): 777-780.

关键词: 间日疟原虫, 醛缩酶, 原核表达, 纯化, 亲和层析

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急性期间日疟患者血浆-干扰素和白细胞介素-17水平分析

孔评石, 陶志勇, 陶莉, 方强, 夏惠

2014, 38(3): 295-296.

关键词: 间日疟, -干扰素, 白介素-17

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Seminar教学法在肝胆胰外科住院医师规范化培训中的应用

刘付宝, 陈江明, 方强, 赵义军, 谢坤, 胡孔旺

2020, 45(6): 825-827. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.06.034

关键词: Seminar教学法, 住院医师, 规范化培训, 肝胆胰外科

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